Cómo se degrada un péptido

Un péptido no se estropea de golpe ni por una sola causa. Se degrada por rutas identificadas, cada una con su residuo vulnerable y su condición favorable, y la secuencia concreta del compuesto decide cuáles de esas rutas están abiertas. Esa es la razón de fondo por la que dos viales de la misma presentación, guardados en el mismo sitio, no envejecen al mismo ritmo.

La revisión de referencia sobre el tema distingue dos familias de inestabilidad, química y física, y recorre por separado la estabilización en solución acuosa y en estado seco (Stability of protein pharmaceuticals: an update, Pharm Res, 2010). Esa división es la que organiza lo que sigue.

Hidrólisis: el enlace que se rompe

Es la ruta más directa. El enlace peptídico se rompe en presencia de agua, y la velocidad depende del pH y de la temperatura. Un péptido en solución está, por definición, en el medio en que esta reacción es posible; un péptido liofilizado no lo está, y esa es la mitad del valor del polvo.

Hay posiciones que la aceleran. En los pentapéptidos estudiados por Tyler-Cross y Schirch, toda secuencia con una serina siguiendo a la asparagina sufrió además una reacción de corte del esqueleto peptídico a pH neutro y alcalino, a una velocidad del orden del diez por ciento de la de la desamidación (Effects of amino acid sequence, buffers, and ionic strength on the rate and mechanism of deamidation of asparagine residues in small peptides, J Biol Chem, 1991). Un corte así no deja residuo visible a simple vista: el vial sigue teniendo polvo o líquido claro, y lo que hay dentro ya son dos fragmentos.

Desamidación: la secuencia decide la velocidad

La asparagina pierde su grupo amida y el residuo se convierte en aspartato o en isoaspartato. Es la reacción no enzimática mejor caracterizada de las que afectan a péptidos pequeños, y su dependencia de la secuencia es llamativamente marcada.

En el trabajo citado se midieron las velocidades de desamidación de la asparagina en una serie de pentapéptidos con secuencias VSNXV y VXNSV, variando X entre diez aminoácidos distintos. El resultado tiene dos partes. El residuo que precede a la asparagina apenas influyó, con independencia de su carga o su tamaño. El que la sigue cambió el resultado por completo: el mayor tamaño y la ramificación de esa cadena lateral redujeron la velocidad hasta setenta veces respecto de la glicina, que en la secuencia Asn-Gly fue la combinación más rápida de todas. La fuerza iónica no tuvo efecto. Y en solución neutra o alcalina los productos aparecieron en una proporción de aproximadamente tres a uno a favor del isoaspartato, mientras que en medio ácido el único producto fue el aspartato.

Setenta veces es un intervalo que no se puede ignorar al comparar dos compuestos. Significa que la vida útil en solución no es una propiedad de la categoría «péptido» sino de la secuencia que se tiene delante.

La desamidación de la asparagina y la isomerización del aspartato comparten mecanismo: las dos transcurren por un intermedio cíclico de imida, cuya formación es el paso limitante a pH fisiológico, y las dos responden al pH y al entorno del disolvente (Formulation considerations for proteins susceptible to asparagine deamidation and aspartate isomerization, J Pharm Sci, 2006). La glutamina es la otra posición amidada que entra en el mismo análisis (Deamidation of asparagine and glutamine residues in proteins and peptides: structural determinants and analytical methodology, J Chromatogr B Biomed Appl, 1994).

Las fichas de este catálogo permiten ver el contraste sin salir del sitio. La secuencia publicada de Epithalon es Ala-Glu-Asp-Gly: no hay asparagina, así que no hay desamidación posible, pero el aspartato ocupa la posición inmediatamente anterior a una glicina, que es la vecindad donde la isomerización por ese mismo intermedio cíclico está descrita. La de Selank es Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro: ni asparagina, ni glutamina, ni metionina, ni cisteína. No es un compuesto más robusto por casualidad ni por grado de pureza, sino porque su secuencia no contiene las posiciones que abren estas rutas.

Oxidación: metionina, cisteína, triptófano

La oxidación ataca cadenas laterales concretas. La metionina y la cisteína son las dos más estudiadas, seguidas del triptófano y la histidina, y el agente puede ser oxígeno disuelto, peróxido residual, un ion metálico de traza que cataliza la reacción, o la luz.

Un análisis mecanístico de la oxidación de metionina por peróxido de hidrógeno calculó la barrera de energía libre para la metionina libre en agua y la comparó con la del residuo dentro de una proteína. El entorno proteico resultó tener un efecto escaso sobre la barrera, y lo que gobierna la cinética es el acceso del disolvente al átomo de azufre (Oxidation of methionine residues in aqueous solutions: free methionine and methionine in granulocyte colony-stimulating factor, J Am Chem Soc, 2004). Para un péptido corto, que no tiene núcleo hidrofóbico donde esconder un residuo, eso significa que una metionina en la cadena está expuesta.

De nuevo el catálogo sirve de ejemplo. La secuencia de Semax es Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro: empieza por metionina y lleva una histidina en tercera posición. La de MOTS-c es MRWQEMGYIFYPRKLR: dos metioninas, un triptófano y una glutamina. Son dos compuestos para los que la protección frente a la luz y frente al aire de cada extracción no es una formalidad del protocolo.

Agregación y pérdida silenciosa

La inestabilidad física no cambia la molécula, cambia su estado. Dos moléculas que se encuentran pueden asociarse de forma irreversible, y a partir de ahí el material deja de estar en disolución aunque el vial parezca igual. La concentración, la temperatura, la agitación y los ciclos de congelación y descongelación son las condiciones que la favorecen, y la revisión de referencia trata la relación entre inestabilidad química y física como un problema único: un residuo modificado químicamente agrega más fácil, y un agregado protege o expone residuos que después reaccionan de otra manera.

Hay además una pérdida que no es degradación y se confunde con ella: la adsorción del péptido a la pared del vial o a la jeringa. A concentraciones bajas esa fracción no es despreciable, y el síntoma es un material que parece haber perdido potencia sin que ningún análisis del contenido muestre un producto de degradación.

Qué de todo esto se puede controlar

De las cuatro rutas, ninguna se cierra por completo y todas se frenan. Lo que un protocolo de manejo controla, en orden de peso real:

• El agua. Mantener el material liofilizado hasta el momento de usarlo es la decisión que más velocidad quita a todas las rutas a la vez. Es la razón de que el polvo viaje a temperatura ambiente y de que se guarde en frío solo cuando está en reposo.
• La temperatura, en reposo y en solución. Donde importa de verdad es después de reconstituir.
• La luz y el aire. Vial protegido y mínimo número de punciones del tapón. Cada extracción introduce aire en el espacio de cabeza.
• El pH del diluyente, porque decide tanto el producto de la desamidación como la velocidad de la hidrólisis.
• El tiempo, contado desde el dato correcto. La fecha que importa no es la de recepción sino la de la primera punción del tapón.

El procedimiento está en cómo reconstituir un péptido y las condiciones por estado, en almacenamiento y estabilidad de péptidos. La aritmética previa la resuelve la calculadora. Y la parte de esto que un proveedor debe poder documentar por lote está en cómo leer un certificado de análisis; el resto de las referencias, en el catálogo.

Referencias

• Stability of protein pharmaceuticals: an update — Pharm Res, 2010.
• Effects of amino acid sequence, buffers, and ionic strength on the rate and mechanism of deamidation of asparagine residues in small peptides — J Biol Chem, 1991.
• Formulation considerations for proteins susceptible to asparagine deamidation and aspartate isomerization — J Pharm Sci, 2006.
• Deamidation of asparagine and glutamine residues in proteins and peptides: structural determinants and analytical methodology — J Chromatogr B Biomed Appl, 1994.
• Oxidation of methionine residues in aqueous solutions: free methionine and methionine in granulocyte colony-stimulating factor — J Am Chem Soc, 2004.